Institut de Chimie & Biologie des Membranes & des Nano-objets • Bordeaux

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Soutenance de thèse de Jiarong Zhang, le 15 décembre 2017, 14 h, amphithéâtre de l'ENSTBB



Jiarong Zhang soutiendra sa thèse,  le 15 décembre 2017, à 14 h, dans l'amphithéâtre de l'ENSTBB, 146 rue Léo Saignat,  Bordeaux.

 

Etude de l'anthocyanidine synthase de Vitis Vinifera: substrats polyphénoliques et mécanismes réactionnels.

 

Résumé

 

L’ANS recombinante de Vitis vinifera (VvANS) a été exprimée chez E. coli, et purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne Nickel.

 

La production et purification de l'holoenzyme chargée en fer a été mise en point, afin d’éviter les réactions d'oxydation non-enzymatique incontrôlée en présence de sel de Fe(II). Un complexe VvANS-Fe(II) stable est formé en présence d'α-cétoglutarate et d'ascorbate, complexe qui est catalytiquement actif à PO2 ambiante en l'absence de sel de Fe(II).

La transformation de la (+)-catéchine par VvANS a été étudiée avec ou sans ascorbate, en utilisant le complexe VvANS-Fe(II) ou l’holoenzyme co-incubée en présence de sulfate ferreux, afin d’étudier le rôle de l’ascorbate. Aucune activité enzymatique n’a été observée en l'absence d’ascorbate, ce qui indique qu'il s'agit d'un cofacteur indispensable de VvANS. Un adduit covalent ascorbate-cyanidine est produit in vitro, mais seulement en l'absence d'un autre réducteur nucléophile majeur, le glutathion GSH.

Les deux stéréoisomères de la leucocyanidine (flavan-diols 3,4-cis et 3,4-trans), substrats potentiels de Vv-ANS,mais non commerciaux, ont été synthétisés par réduction de la dihydroquercétine par NaBH4, puis identifiés par RMN du proton. L'analyse des deux stéréoisomères par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) montre que leurs voies de fragmentation MS/MS sont distinctes et peuvent être utilisées pour les distinguer lors de leur production. Les deux stéréoisomères sont stables en milieu aqueux congelé à -20°C.

Douze flavonoïdes de quatre familles distincts (flavanones, dihydroflavonols, flavan-3-ols et flavan-3,4-diols) ont été testés comme substrats potentiels. Tous les produits enzymatiques ont été purifiés par HPLC en phase inverse, puis identifiés par MS/MS, avec les résultats suivants:

1) Seuls les dihydroflavonols de configuration (2R,3R) sont acceptés comme substrats par VvANS dont l'activité diminue avec le nombre de groupements hydroxyle du cycle B.

2) Seuls les flavan-3-ols ou flavan-3,4-diols de configuration (2R,3S) ayant un catéchol ou trois OH phénoliques vicinaux sur le cycle B sont acceptés comme substrats.

3) La naringénine n'est pas substrat de Vv-ANS, sans doute en raison de l'absence de groupement hydroxyle en C3.

4) La 3,4-cis-leucocyanidine (stéréoisomère naturel) est transformée en deux produits majeurs, la quercétine et le flavan-3,3,4-triol (gem-diol en C3) au lieu de la cyanidine. La 3,4-trans-leucocyanidine est aussi un substrat de VvANS, et elle est transformée en cinq produits, (+)-DHQ, (-)-épiDHQ, cyanidine, quercétine et flavan-3,3,4-triol (gem-diol en C3 stéréoisomère du précédent). Un intermédiaire flavan-3,3-gem-diol dérivé de la (+)-catéchine a aussi été observé par monitorage en temps réel de la transformation de (+)-catéchine par MS, ainsi qu’un intermédiaire flav-2-en-3-ol. Tous ces résultats sont compatibles avec l'idée que la première étape catalytique de l’ANS est une hydroxylation en C3 produisant systématiquement un gem-diol.

 

Le glutathion GSH est un puissant nucléophile, réducteur et piégeur de radicaux libres, qui est abondant dans la baie de raisin. Nous avons donc étudié son effet sur l'activité de VvANS avec tous les substrats identifiés. GSH n’a pas d'effet sur la transformation des dihydroflavonols et des flavan-3,4-diols, mais il modifie considérablement le mode de transformation de la (+)-catéchine et de la (+)-gallocatéchine. En présence de (+)-catéchine et de GSH, on observe deux produits majeurs, la cyanidine et un adduit thioéther cyanidine-glutathion, et le rendement de production est beaucoup plus élevé qu'en l'absence de GSH. De plus, l’adduit covalent ascorbate-cyanidine et le dimère issu de la (+)-catéchine obtenus lors de la réaction réalisée en l'absence de GSH ont disparu. Nos données suggèrent que l'adduit covalent cyanidine-glutathion est un thioéther en C4 qui fait l'objet d'un équilibre de tautomérisation céto-énolique en C3, et se décompose en cyanidine et GSH. En présence de (+)-gallocatéchine, un adduit thioéther similaire delphinidine-glutathion est aussi observé. Pour tester l'éventuelle spécificité de GSH, trois autres mercaptans (thiomalate, cystéine et cystéamine) ont été testés et aucun adduit similaire n’a été observé, ce qui suggère que GSH est un ligand spécifique, et pourrait être un coenzyme de VvANS.

 

Nos résultats suggèrent que les anthocyanidines pourraient être produites in vivo à partir d'un substrat flavan-3ol (catéchine ou gallocatéchine) via un intermédiaire thioéther de glutathion, alors que le stéréoisomère naturel (3,4-cis) de la leucocyanidine n'est pas transformé en cyanidine

 

 

 

Mots clés : Anthocyanidine synthase; oxygénase; oxoglutarate; ascorbate; glutathion; leucocyanidine

Encadrement: Jean Chaudière.

Equipe : Structure et Activité des Macromolécules Biologiques.

 

Jury:

 

Jalila Simmaan, Chargée de Recherche, CNRS, Université d'Aix-Marseille, Rapporteur

Véronique Cheynier, Directrice de Recherche, INRA, Université de Montpellier, Rapporteur

Sandrine Boschi, Professeur, Université de Lorraine, Examinateur

Olivier Dangles, Professeur, Université d'Avignon, Examinateur

Jean-Marie Schmitter, Professeur, Université de Bordeaux, Examinateur

Claudine Trossat-Magnin, Maître de Conférence, Université de Bordeaux, Invitée.

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