Institut de Chimie & Biologie des Membranes & des Nano-objets • Bordeaux

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Extracellular Vesicles and Membrane Repair

L'équipe Vésicules Extracellulaires et Réparation Membranaire développe deux axes de recherches :

  • Vésicules extracellulaires. Au niveau fondamental, notre objectif est d’imager et compter les vésicules extracellulaires (les EVs englobent les microvésicules, les microparticules et les exosomes.) dans le plasma sanguin de sujets sains, et d’établir le catalogue de référence permettant d’aborder l’étude des EVs dans des contextes pathologiques, ainsi que dans d’autres liquides biologiques (Refs 1-4). Au niveau appliqué, notre objectif est de développer des outils et tests pour le diagnostic basés sur la détection et la quantification d’EVs, en priorité dans le cas de désordres thrombotiques. Nos approches méthodologiques combinent la cryo-microscopie électronique, la synthèse de nanoparticules d’or fonctionnalisées par l’Annexine-5 ou des anticorps pour le marquage spécifique des EVs, et la cytométrie en flux.
  • Rôle de l’Annexine-5 et des annexines dans la réparation membranaire. Notre équipe a récemment mis en évidence le rôle fondamental joué par l’Annexine-5 dans la réparation des membranes plasmiques au niveau de cellules périvasculaires (Ref. 5). Notre objectif est d’étudier le rôle de l’Annexine-5 et d’autres annexines dans la machinerie de réparation membranaire, principalement au niveau du placenta (Ref. 6) et de cellules musculaires. Nos approches méthodologiques combinent la microscopie confocale, l’irradiation laser ainsi que l’immuno-histochimie et l’utilisation de stratégies siARN et shARN.

FAITS MARQUANTS

1- Le "catalogue" des Vésicules Extracellulaires du plasma révélé par cryo-microscopie électronique et marquage immuno-gold.

 

Figure : (gauche), Image de cryo-MET montrant une nano-gouttelette de plasma sanguin pur, congelé, contenant deux vésicules extracellulaires. La vésicule « 1 » est fortement marquée par des nanoparticules d’or conjuguées à l’Annexine-5, indiquant que cette vésicule expose la phosphatidylsérine (PS), lipide pro-coagulant. (droite), Schéma d’une nanoparticule d’or conjuguée à l’Annexine-5, outil assurant le marquage des  membranes exposant la PS. La spécificité du marquage est remarquable. (adapté de Ref. 1).

 

2- Quantification et phénotypage des Vésicules Extracellulaires du plasma sanguin par une nouvelle approche de cytométrie en flux.

 

Figure. Analyse par cytométrie en flux (FCM) des EVs exposant la phosphatidylsérine (PS) au sein d’un échantillon de plasma sanguin (PFP, platelet free plasma). Les EVs PS-positives, marquées par l’Annexine-5 fluorescente sont représentées en rouge. (gauche), dans la méthode conventionnelle de FCM, les objets sont détectés sur la base de leur signal de diffusion de la lumière ; (droite), dans la méthode alternative de FCM, les objets sont détectés sur la base de leur signal de fluorescence. Dans l’exemple présenté ici, cette nouvelle approche permet de détecter 50 fois plus d’EVs que la méthode conventionnelle. (adapté de REF. 2).

 

3- Elucidation du rôle de l’Annexine-A5 dans la réparation des membranes cellulaires

Figure. A l’état de repos (a), la membrane plasmique sépare le milieu intra-cellulaire riche en Annexine-5 (rectangles rouges) et en phosphatidylsérine (PS, points noirs) et pauvre en Ca2+ (~µM) du milieu extra-cellulaire riche en Ca2+ (~mM). Lors de la rupture de la membrane plasmique (b), un continuum est créé entre les milieux intra- et extra-cellulaires, et d’autre part le cytosquelette sous-jacent crée une tension qui tend à agrandir la rupture. La formation d’une rupture membranaire engendre des conditions favorisant la liaison de l’Annexine-5 aux membranes riches en PS (c) et la formation d’un réseau bi-dimensionnel au niveau des zones entourant la déchirure (d). La formation des réseaux 2D d’Annexine-5 favorise la réparation des dommages membranaires. (adapté de Ref. 5).

 

References

1- N. Arraud, R. Linares, S. Tan, C. Gounou, J.-M. Pasquet, S. Mornet, A.R. Brisson. Extracellular Vesicles from Blood Plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. The Journal of Thrombosis and Haemostasis 2014 12: 614–627.

2- N. Arraud, C. Gounou, R. Linares, A.R. Brisson. A Simple Flow Cytometry Method Improves the Detection of Phosphatidylserine-Exposing Extracellular Vesicles. The Journal of Thrombosis and Haemostasis DOI: 10.1111/jth.12767.

3- M.I. Zonneveld, A.R. Brisson, M.J. C. van Herwijnen, S. Tan, C.H.A. van de Lest, F.A. Redegeld, J. Garssen, M.H.M. Wauben and E.N.M. Nolte-’t Hoen. Recovery of extracellular vesicles from human breast milk is influenced by sample collection and vesicle isolation procedures.The Journal of Extracellular Vesicles 2014, 3: 24215-http://dx.doi.org/10.3402/jev.v3.24215.

4- Cloutier N, Tan S, Boudreau LH, Cramb C, Subbaiah R, Lahey L, Albert A, Shnayder R, Gobezie R, Nigrovic PA, Farndale RW, Robinson WH, Brisson A, Lee DM, Boilard E. The exposure of autoantigens by microparticles underlies the formation of potent inflammatory components: the microparticle-associated immune complexes. EMBO Mol Med. 2013 (2):235-249.

5- A. Bouter, C. Gounou, R. Bérat, S. Tan, B. Gallois, T. Granier, B. Langlois d’Estaintot,E. Pöschl, B. Brachvogel, A.R. Brisson. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications 2011, 2, 270:1-9.

 

Chef d'équipe

BRISSON Alain

Alain BRISSON

Professeur

CBMN

Allée Geoffroy Saint Hilaire, Bât B14
33600 Pessac
Tél. : +33 (0)5 40 00 68 00
contact@cbmn.u-bordeaux.fr

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